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《碱性成纤维细胞生长因子透巩膜转运至视网膜的实验研究

作者:乐之翼
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2011-01-27

 
夏小平 赵丽娜 田东华
(中山大学附属第三医院眼科。)
[注:本文原载于《眼科研究》2007年第1期,感谢作者同意在本网站转载!其它网站如需转发,须征得作者本人同意,特此声明!]
摘要  目的  探讨碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)可否通过透巩膜转运进入视网膜内。方法  125I标记于bFGF,经手术将浸有125I-bFGF(实验眼)或生理盐水(对照眼或空白眼)的海棉片置于家兔巩膜深层,术后第一、三天检测实验眼、对照眼和空白眼脉络膜、视网膜和玻璃体三种组织中的125I-bFGF相对含量。结果  术后第一天和第三天,实验眼脉络膜和视网膜中125I-bFGF相对含量都显著高于对照眼和空白眼,但随时间的推移125I-bFGF相对含量下降,术后第一天实验眼玻璃体中的125I-bFGF相对含量亦显著高于对照眼和空白眼。结论  bFGF可通过透巩膜转运进入视网膜中。
关键词  碱性成纤维细胞生长因子;透巩膜转运;视网膜;家兔
 
我们在视网膜色素变性(Retinitis Pigmentosa,RP)治疗学的基础研究中,根据碱性成纤维细胞生长因子(Basic Fibroblast Growth Factor, bFGF)能延缓视网膜光感受器细胞凋亡、对退化的光感受器细胞在组织学上和功能上具有营救作用的论述[1-2],对人雪旺细胞分泌bFGF的情况[3]及家兔自体雪旺细胞移植到巩膜深层的生长情况进行了探索[4],发现在培养液中bFGF、睫状神经营养因子(CNTF)和脑源性神经营养因子(BDNF)的浓度随培养时间的推移而升高,其中bFGF的浓度显示出高于CNTF和BDNF浓度的趋势,同时发现移植后的雪旺细胞在巩膜深层可进行分裂增殖并至少存活60天以上,但对于巩膜深层的雪旺细胞分泌的bFGF能否进入视网膜内尚无确切证据,因此本文用同位素示踪的方法对此进行实验研究。
材料和方法
1、125I-bFGF的制备
bFGF由珠海亿胜生物制药公司提供浓度为1.4mg/ml的bFGF原液。125I经氯胺T法标记于bFGF,用阴离子交换树脂柱分离纯化标记物,并用纸层析和SDS-聚丙稀酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)两种方法鉴定125I-bFGF放化纯。125I-bFGF标记比活性为2.3-3.8×106 Bq/μg,放射性浓度在1.7-2.4×109cpm/ml之间,放化纯度>95%。标记后bFGF在4℃以下保存。
2、实验动物和分组
从中山大学医学动物实验中心购买健康Ⅰ级新西兰白兔12只,体重2.3±0.65kg,月龄5±0.5月。动物许可证号:粤监证字2004A098。家兔随机分成3组,每组4只,12只家兔手术步骤一样,但其中有二组为实验组(右眼植入含125I-bFGF的棉片,左眼植入含生理盐水的棉片),另一组为空白组(手术步骤同实验眼,但双眼都植入含生理盐水的棉片)。
3、手术过程
家兔麻醉后,沿角巩缘8:00-1:00点剪开球结膜,暴露颞上象限赤道后巩膜,在上直肌和外直肌之间距角膜缘后10mm处巩膜上用剃须刀片和3.2mm一次性手术刀做一开口朝前、深达4/5巩膜厚度能隐约透见脉络膜、大小约5×5mm的巩膜囊袋。将3×3mm大小浸有125I-bFGF(实验眼)或生理盐水(对照眼和空白眼)的明胶海棉片用10-0尼龙线固定在巩膜囊袋正中,封闭囊袋开口,并用5-0丝线标记手术区。整复球结膜和筋膜,10-0尼龙线连续对位缝合。结膜下注射庆大霉素和地塞米松,结膜囊涂妥布霉素眼膏。双眼手术步骤一样。
4、取样和检测
术后1、3天各从3组中每组随机取2兔(即每天6只兔,其中实验组4只兔、空白组2只兔,也即实验眼、对照眼和空白眼各4只)取眼组织标本进行检测,步骤如下。按眼球摘除法取出眼球,去除巩膜囊袋内的明胶海棉片后,用无菌生理眼水充分冲洗眼球(以防止同位素污染)后固定在塑胶板上,抽吸0.5 ml玻璃体,然后取视网膜、脉络膜并用无菌生理眼水冲洗、吸干、称重后放入试管,其中视网膜和脉络膜用离心机1000转/min离心5 min后,去除上清液。
用FT-613自动计数125I放免测量仪测定放射比活性(cpm)表示125I-bFGF在组织中的相对含量,并将结果换算成每ml玻璃体、每g视网膜和每g脉络膜的含量。检测数据中未减去仪器的本底。
5、数据处理
用成组比较的t检验法对数据进行统计学分析。
结    果
一、术后第一、三天125I-bFGF在各组家兔三种眼组织中的相对含量见图1,可见术后第一天在实验眼三种组织中的125I-bFGF相对含量都明显高于对照眼和空白对照眼,对照眼的125I-bFGF相对含量高于空白眼;术后第三天实验眼的125I-bFGF相对含量高于对照眼和空白眼,但对照眼和空白眼之间的125I-bFGF相对含量似无区别。
 
二、各组数据之间显著性比较结果见表1。术后第一天,实验眼三种组织中的125I-bFGF相对含量都显著高于对照眼和空白眼,同时实验眼中脉络膜的125I-bFGF相对含量显著高于视网膜;对照眼玻璃体和视网膜中的125I-bFGF相对含量亦显著高于空白眼,而对照眼和空白眼脉络膜中的125I-bFGF相对含量无显著差别。术后第三天,实验眼三种组织中的125I-bFGF相对含量大都显著高于对照眼和空白眼(但实验眼和对照眼玻璃体内的125I-bFGF相对含量无显著差别),实验眼视网膜和脉络膜之间的125I-bFGF相对含量无显著差别;对照眼与空白眼三种组织之间的125I-bFGF相对含量亦无显著差别。不论是术后第一天还是第三天,亦不论是对照眼还是空白眼,其视网膜和脉络膜之间的125I-bFGF相对含量无显著差别。
 
 
表1  实验眼、对照眼和空白眼术后三种组织中125I-bFGF相对含量的显著性检验
Tab 1 Test of significance among the relative contents of 125I-bFGF in choroids, retinas and vitreous bodies of experimental, control and blank control eyes at the 1st and 3rd postoperative days
 
1st postoperative days
3rd postoperative days
 
vitreous body
retina
choroids
vitreous body
retina
choroids
Experi-
mental eyes
*P<0.001
#P<0.001
* P<0.01
# P<0.01
% P<0.05
* P<0.01
#P<0.001
* P>0.05
# P<0.05
* P<0.05
# P<0.05
% P>0.05
* P<0.05
# P<0.05
Control eyes
$ P<0.01
$ P<0.05
% P>0.05
$ P>0.05
$ P>0.05
$ P>0.05
% P>0.05
$ P>0.05
Blank control eyes
 
% P>0.05
 
 
% P>0.05
 
*Compared between experimental and control eyes,# Compared between experimental and bland control eyes, $ Compared between control and blank control eyes,% Compared between retina and choroids.
 
讨    论
巩膜是一种具有弹性的多微孔组织,由蛋白多糖(proteoglycan)和密集的胶原纤维组成,含水量接近70%,其渗透性通道是胶原纤维间的凝胶样蛋白多糖水媒,药物及有生物活性的大分子物质甚至高达150 kD的抗体可以通过渗入性巩膜穿透转运,在视网膜及脉络膜里达到潜在治疗浓度[5-6],bFGF分子量为18-23 kD,因此通过渗入性巩膜穿透转运进入视网膜是可能的。
本实验中,术后第一天,实验眼三种组织中的125I-bFGF相对含量都显著高于对照眼和空白眼,说明通过手术使巩膜变薄后bFGF确实可进入眼内;而实验眼中脉络膜的125I-bFGF相对含量显著高于视网膜,说明bFGF进入眼内后在脉络膜中有一个储积过程,这个过程通过血液循环使对照眼玻璃体和视网膜中的125I-bFGF相对含量亦显著高于空白眼。术后第三天,实验眼三种组织中的125I-bFGF相对含量大都显著高于对照眼和空白眼,但绝对数值高出不多,而实验眼视网膜和脉络膜之间的125I-bFGF相对含量无显著差别,推测这是由于bFGF作为药物在体内随血液循环有一个衰减过程所致,而不是由于125I的衰减,因为125I的半衰期为60天。
至于125I-bFGF进入眼内过程中的血-视网膜屏障问题,本实验未作专门的设计和探讨,但由于神经营养因子可通过血-脑屏障[7],而内层血-视网膜屏障和血-脑屏障都是由紧密连接的毛细血管内皮细胞组成,所以推测神经营养因子也可以通过血-视网膜屏障,本实验的结果也说明上述推测可能是正确的。
参考文献
1、Xiao M, Sastry SM, Li ZY, et al.Effects of retinal laser photocoagulation on photoreceptor basic fibroblast growth factor and survival.Invest Ophthalmol Vis Sci, 1998,39:618
2、Ali RR, Sarra GM, Stephens C,et al. Restoration of photoreceptor ultrastructure and function in retinal degeneration slow mice by gene therapy. Nat Genet, 2000,25:306.
3、蔡军勇,夏小平,邓娟.人雪旺氏细胞分泌神经营养因子浓度的测定.眼视光学杂志,2005,7:173
4、蔡军勇,夏小平,邓娟,等.家兔自体雪旺细胞巩膜深层移植的病理观察.中华眼科杂志,2006,42:540
5、Ambati J, Canakis CS, Miller JW, et al. Difusion of high molecular weight compounds through sclera. Invest Ophthalmol Vis Sct, 2000, 41:1181
6、Ambati J, Adamis AP. Transscleral drug delivery to the retina and choroid. Prog Retin Eye Res, 2002 Mar,21:145
7、Pan W, Banks WA, Fasold MB, et al. Transport of brain-derived neurotrophic factor across the blood-brain barrier. Neurotropharmacology, 1998,37:1553
 
致谢:中山大学临床核实验教研室帮助制备并检测标本中的125I-bFGF。
 
 
 
 
 
 
 
地址:广州市天河路600号 中山大学附属第三医院眼科
邮编:510630
电话:夏小平 13600045911
 
单位介绍信另寄。

录入:伊然 添加:2011-01-27
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