夏小平 赵丽娜 田东华
(中山大学附属第三医院眼科。)
[注:本文原载于《眼科研究》2007年第1期,感谢作者同意在本网站转载!其它网站如需转发,须征得作者本人同意,特此声明!]
摘要 目的 探讨碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)可否通过透巩膜转运进入视网膜内。方法 将125I标记于bFGF,经手术将浸有125I-bFGF(实验眼)或生理盐水(对照眼或空白眼)的海棉片置于家兔巩膜深层,术后第一、三天检测实验眼、对照眼和空白眼脉络膜、视网膜和玻璃体三种组织中的125I-bFGF相对含量。结果 术后第一天和第三天,实验眼脉络膜和视网膜中125I-bFGF相对含量都显著高于对照眼和空白眼,但随时间的推移125I-bFGF相对含量下降,术后第一天实验眼玻璃体中的125I-bFGF相对含量亦显著高于对照眼和空白眼。结论 bFGF可通过透巩膜转运进入视网膜中。
关键词 碱性成纤维细胞生长因子;透巩膜转运;视网膜;家兔
我们在视网膜色素变性(Retinitis Pigmentosa,RP)治疗学的基础研究中,根据碱性成纤维细胞生长因子(Basic Fibroblast Growth Factor, bFGF)能延缓视网膜光感受器细胞凋亡、对退化的光感受器细胞在组织学上和功能上具有营救作用的论述[1-2],对人雪旺细胞分泌bFGF的情况[3]及家兔自体雪旺细胞移植到巩膜深层的生长情况进行了探索[4],发现在培养液中bFGF、睫状神经营养因子(CNTF)和脑源性神经营养因子(BDNF)的浓度随培养时间的推移而升高,其中bFGF的浓度显示出高于CNTF和BDNF浓度的趋势,同时发现移植后的雪旺细胞在巩膜深层可进行分裂增殖并至少存活60天以上,但对于巩膜深层的雪旺细胞分泌的bFGF能否进入视网膜内尚无确切证据,因此本文用同位素示踪的方法对此进行实验研究。
材料和方法
1、125I-bFGF的制备
bFGF由珠海亿胜生物制药公司提供浓度为1.4mg/ml的bFGF原液。125I经氯胺T法标记于bFGF,用阴离子交换树脂柱分离纯化标记物,并用纸层析和SDS-聚丙稀酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)两种方法鉴定125I-bFGF放化纯。125I-bFGF标记比活性为2.3-3.8×106 Bq/μg,放射性浓度在1.7-2.4×109cpm/ml之间,放化纯度>95%。标记后bFGF在4℃以下保存。
2、实验动物和分组
从中山大学医学动物实验中心购买健康Ⅰ级新西兰白兔12只,体重2.3±0.65kg,月龄5±0.5月。动物许可证号:粤监证字2004A098。家兔随机分成3组,每组4只,12只家兔手术步骤一样,但其中有二组为实验组(右眼植入含125I-bFGF的棉片,左眼植入含生理盐水的棉片),另一组为空白组(手术步骤同实验眼,但双眼都植入含生理盐水的棉片)。
3、手术过程
家兔麻醉后,沿角巩缘8:00-1:00点剪开球结膜,暴露颞上象限赤道后巩膜,在上直肌和外直肌之间距角膜缘后10mm处巩膜上用剃须刀片和3.2mm一次性手术刀做一开口朝前、深达4/5巩膜厚度能隐约透见脉络膜、大小约5×5mm的巩膜囊袋。将3×3mm大小浸有125I-bFGF(实验眼)或生理盐水(对照眼和空白眼)的明胶海棉片用10-0尼龙线固定在巩膜囊袋正中,封闭囊袋开口,并用5-0丝线标记手术区。整复球结膜和筋膜,10-0尼龙线连续对位缝合。结膜下注射庆大霉素和地塞米松,结膜囊涂妥布霉素眼膏。双眼手术步骤一样。
4、取样和检测
术后1、3天各从3组中每组随机取2兔(即每天6只兔,其中实验组4只兔、空白组2只兔,也即实验眼、对照眼和空白眼各4只)取眼组织标本进行检测,步骤如下。按眼球摘除法取出眼球,去除巩膜囊袋内的明胶海棉片后,用无菌生理眼水充分冲洗眼球(以防止同位素污染)后固定在塑胶板上,抽吸0.5 ml玻璃体,然后取视网膜、脉络膜并用无菌生理眼水冲洗、吸干、称重后放入试管,其中视网膜和脉络膜用离心机1000转/min离心5 min后,去除上清液。
用FT-613自动计数125I放免测量仪测定放射比活性(cpm)表示125I-bFGF在组织中的相对含量,并将结果换算成每ml玻璃体、每g视网膜和每g脉络膜的含量。检测数据中未减去仪器的本底。
5、数据处理
用成组比较的t检验法对数据进行统计学分析。
结 果
一、术后第一、三天125I-bFGF在各组家兔三种眼组织中的相对含量见图1,可见术后第一天在实验眼三种组织中的125I-bFGF相对含量都明显高于对照眼和空白对照眼,对照眼的125I-bFGF相对含量高于空白眼;术后第三天实验眼的125I-bFGF相对含量高于对照眼和空白眼,但对照眼和空白眼之间的125I-bFGF相对含量似无区别。
二、各组数据之间显著性比较结果见表1。术后第一天,实验眼三种组织中的125I-bFGF相对含量都显著高于对照眼和空白眼,同时实验眼中脉络膜的125I-bFGF相对含量显著高于视网膜;对照眼玻璃体和视网膜中的125I-bFGF相对含量亦显著高于空白眼,而对照眼和空白眼脉络膜中的125I-bFGF相对含量无显著差别。术后第三天,实验眼三种组织中的125I-bFGF相对含量大都显著高于对照眼和空白眼(但实验眼和对照眼玻璃体内的125I-bFGF相对含量无显著差别),实验眼视网膜和脉络膜之间的125I-bFGF相对含量无显著差别;对照眼与空白眼三种组织之间的125I-bFGF相对含量亦无显著差别。不论是术后第一天还是第三天,亦不论是对照眼还是空白眼,其视网膜和脉络膜之间的125I-bFGF相对含量无显著差别。
表1 实验眼、对照眼和空白眼术后三种组织中125I-bFGF相对含量的显著性检验
Tab 1 Test of significance among the relative contents of 125I-bFGF in choroids, retinas and vitreous bodies of experimental, control and blank control eyes at the 1st and 3rd postoperative days
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1st postoperative days
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3rd postoperative days
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vitreous body
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retina
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choroids
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vitreous body
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retina
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choroids
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Experi-
mental eyes
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*P<0.001
#P<0.001
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* P<0.01
# P<0.01
% P<0.05
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* P<0.01
#P<0.001
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* P>0.05
# P<0.05
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* P<0.05
# P<0.05
% P>0.05
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* P<0.05
# P<0.05
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Control eyes
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$ P<0.01
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$ P<0.05
% P>0.05
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$ P>0.05
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$ P>0.05
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$ P>0.05
% P>0.05
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$ P>0.05
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Blank control eyes
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% P>0.05
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% P>0.05
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*Compared between experimental and control eyes,# Compared between experimental and bland control eyes, $ Compared between control and blank control eyes,% Compared between retina and choroids.
讨 论
巩膜是一种具有弹性的多微孔组织,由蛋白多糖(proteoglycan)和密集的胶原纤维组成,含水量接近70%,其渗透性通道是胶原纤维间的凝胶样蛋白多糖水媒,药物及有生物活性的大分子物质甚至高达150 kD的抗体可以通过渗入性巩膜穿透转运,在视网膜及脉络膜里达到潜在治疗浓度[5-6],bFGF分子量为18-23 kD,因此通过渗入性巩膜穿透转运进入视网膜是可能的。
本实验中,术后第一天,实验眼三种组织中的125I-bFGF相对含量都显著高于对照眼和空白眼,说明通过手术使巩膜变薄后bFGF确实可进入眼内;而实验眼中脉络膜的125I-bFGF相对含量显著高于视网膜,说明bFGF进入眼内后在脉络膜中有一个储积过程,这个过程通过血液循环使对照眼玻璃体和视网膜中的125I-bFGF相对含量亦显著高于空白眼。术后第三天,实验眼三种组织中的125I-bFGF相对含量大都显著高于对照眼和空白眼,但绝对数值高出不多,而实验眼视网膜和脉络膜之间的125I-bFGF相对含量无显著差别,推测这是由于bFGF作为药物在体内随血液循环有一个衰减过程所致,而不是由于125I的衰减,因为125I的半衰期为60天。
至于125I-bFGF进入眼内过程中的血-视网膜屏障问题,本实验未作专门的设计和探讨,但由于神经营养因子可通过血-脑屏障[7],而内层血-视网膜屏障和血-脑屏障都是由紧密连接的毛细血管内皮细胞组成,所以推测神经营养因子也可以通过血-视网膜屏障,本实验的结果也说明上述推测可能是正确的。
参考文献
1、Xiao M, Sastry SM, Li ZY, et al.Effects of retinal laser photocoagulation on photoreceptor basic fibroblast growth factor and survival.Invest Ophthalmol Vis Sci, 1998,39:618
2、Ali RR, Sarra GM, Stephens C,et al. Restoration of photoreceptor ultrastructure and function in retinal degeneration slow mice by gene therapy. Nat Genet, 2000,25:306.
3、蔡军勇,夏小平,邓娟.人雪旺氏细胞分泌神经营养因子浓度的测定.眼视光学杂志,2005,7:173
4、蔡军勇,夏小平,邓娟,等.家兔自体雪旺细胞巩膜深层移植的病理观察.中华眼科杂志,2006,42:540
5、Ambati J, Canakis CS, Miller JW, et al. Difusion of high molecular weight compounds through sclera. Invest Ophthalmol Vis Sct, 2000, 41:1181
6、Ambati J, Adamis AP. Transscleral drug delivery to the retina and choroid. Prog Retin Eye Res, 2002 Mar,21:145
7、Pan W, Banks WA, Fasold MB, et al. Transport of brain-derived neurotrophic factor across the blood-brain barrier. Neurotropharmacology, 1998,37:1553
致谢:中山大学临床核实验教研室帮助制备并检测标本中的125I-bFGF。
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