RP老鼠模型的视干感光细胞退化

 

黄傅敦教授

（编者按：本文根据黄傅敦教授在“华夏视网膜病变研讨会 2005”的演讲现场录音整理，文稿经黄教授协助校阅。黄傅敦教授早年在香港接受中学教育，后到美国发展，现任美国杜克大学眼科学系教授兼科学总监。他近十多年来一直从事与视网膜色素变性（RP）治疗和疾病机理有关的研究工作，取得瞩目成就。本文题目看似深奥，但黄教授透过深入浅出的表达，令外行人也能明白其中机理。）

 

首先恭贺香港视网膜病变协会成立十周年纪念，并感谢大会给我这个机会，分享在RP研究工作的进展。

这两天听到很多新的消息，昨天几位教授报告RP不是没法医治，中医有很明显的治疗方法；今天上午听到夏小平教授谈及人工视网膜细胞移植，有药物的治疗；郭坤豪医生也讲到手术可以治疗。其实在病人或动物方面不是没有治疗，关键是没有一种治疗有特别明显的疗效，特别是有些治疗，初期好象有一些进步，但很快又失效，病情回复原状。

在动物方面，有很多实验，研究人员报告有很大的进展。例如有不同的方法可使视网膜退化拖慢，虽有希望，但未知实际原因何在。由于未能完全了解，现在暂时仍未可以说那些治疗有持续的效果。

另一个在这里多次提及的问题，是中医与西医观念不一致。中医的做法是因人来治疗，这观念在西方难以接受。按西方的看法，治疗方法不能令人明白，同样的方法传授下去，治疗其它病人是否有效令人怀疑，这是西方难以接受和理解的。现在仍未有一种方法，能完全清楚说明是很有效的治疗。然而，世界各地的科学家都在很积极努力。

今天早上有一位朋友提问，会不会是经济上的问题，或是什么其它原因，令RP的治疗比其它治疗进展慢。其实不是金钱的问题，世界上有些RP病人是很有钱的，要花大量金钱把病治好，对他们来说不是主要问题。主要问题是基因突变，这是RP研究的一个很特别的情形，因为太多突变可以引起这种病，所以，今天我所讲的题目，就是动物模型的研究，也是这两天我听到其它教授的演讲，已经很明显讲到动物对治疗病人过程中的角色，现在开始讲我研究的方向。

引致RP的基因突变实在太多，已查明的有三十多个。从1990年第一个突变公布之后，我开始有一个观念，这么多不同的基因，这么多不同的突变，都可以引起RP，开始的时候是夜盲，接着视野逐渐缩窄，到中年时，中心视力已经明显退化。在细胞层面，夜盲即视干细胞受骚扰，失去功能；然后视锥细胞也出问题，使视力减弱。
为什么RP被认为是一种病？以前不知道基因的细节，认为这样的病理，这样的过程，共同的表征，就叫做RP。但由于这么多不同的基因突变，都可引致共同的表征。我开始接受这样的概念架构：看到这么多不同的突变，这么多不同的基因，都引起共同的表征，似乎每一个突变只不过是引起一些步骤，这些步骤最后是通过一些下游。所谓下游，就是刚才叶社平教授介绍，当一个基因讯号转到蛋白，去表达这个蛋白，在细胞里面又同其它的蛋白互相作用来发挥功能，是一件很复杂的事，所以基因只不过是第一步，而下游就是由基因讯息一路到表达蛋白，甚至在细胞程序里面，下游机理在概念架构里，重点是在基因之下可能会产生机能机理，但还未知道是什么机理，直至引起RP的表征，我继续讲下去，大家对这个概念会较为了解。

在这个概念架构之下，一个简单的问题是，是什么下游机理引起RP的表征。这个问题最好是用动物来解答。我用的动物模型是常染色体显性（ADRP），包括小鼠和猪。今天大家都讲到大动物的重要性，我在十年前用过遗传工程做过猪的模型，使猪的基因变成跟病人的一样，作为显性RP的研究模型。

在1990年发表第一个RP基因突变后，当时我立刻用遗传工程制造了动物小鼠，把突变放入小鼠内，观察老鼠的表达表征，果然看到视干细胞一路在消失。在正常情况下，老鼠有十层视干细胞核，几个星期内开始变薄，大约一年后，只剩下一层。由十层变作一层，这符合RP在病人内的病理。

如果把这些数字划图，会发觉视干细胞的消失不是直?的。在最初几个星期没有什么变化，到了三个星期，突然间很快消失了差不多一半，在一个星期内可以不见了一半，余下的那些要十个月至十一个月才消失。

这次开会大家听到一个叫“凋亡”的术语。雕亡是一种很特别的死亡过程，不是普通的死亡，“凋”的意思是花雕谢的意味，花开花落是一种自然的过程，所以雕亡在生理上也是一种自然的过程。就好象发育，当一个人未成熟的时候，很多细胞属暂时需要或多余。成熟的时候，就要将那些多余的、不对的消除。在这个过程里面，消失了的细胞就是经过雕亡的步骤，不是随便死亡，而是经过一个特别的过程，差不多静静地消失，不影响其它的细胞，包括成熟的细胞。“凋亡”这个字翻译得很有意义。

我们可以看看正常的老鼠视网膜，当它生下来一周的时候，用一种特别的技术可以看到雕亡的细胞，这些雕亡的细胞在内核层，感光细胞在外核层。内核层是其它的神经细胞，大家看到一粒粒黑色那些就是雕亡的细胞。我们再看看另一边的动物模型，那是有基因347S突变的视网膜，老鼠诞生一周后都看到雕亡的细胞，跟正常的没有什么分别。正常的老鼠两周已经不见了这些雕亡的细胞，而RP动物模型也是这样的情形。但是，到了第三周，动物模型内核层感光细胞核突然又出现雕亡，而正常的老鼠没有出现。正常老鼠已经是发育成熟，不再出现雕亡；RP老鼠模型则再度呈现雕亡，而且在连续两个星期都看到数字相当高。如划图表示，在20日、21日、第三周的时候突然间上升，维持一个星期。这个过程符合刚才我讲的，一半的感光细胞在一个星期内就消失了。

关于“凋亡”的文章首先在1993年发表，当时我的想法是，结果表示不仅在突变遗传工程制造出来的小鼠模型，甚至在RCS老鼠里面都是有同样类似的表现。所以我们当时的结论认为，雕亡就是共同的途径，使到感光细胞在几个动物模型里都消失了。论文在1993和1994年发表后，美国其它的科学家和其它实验室也有同样的发现。这是在西方搞研究的一个重要因素，当大家愿意接受这个结果的时候，就是因为你讲的与你的做法，人家可以照做，结果是一样的。研究证明，雕亡可由不同的基因突变引发，所以似乎是共同的途径。

第二个问题，雕亡发生在个别的视干细胞，在这样的情形之下，个别细胞的雕亡对他旁边的细胞有什么影响呢？大家不要忘记，这些细胞不是突然间消失，这也是一个谜，是个很重要的谜。细胞含有基因，基因出现突变，既然每一个细胞都有基因，都有这样的突变，为什么不会同时消失？正如在小鼠模型里，为什么细胞要一年才全部消失？个别细胞的鉹`怎样影响他的邻居？

这是1992和1993年所做的实验。在小鼠里面可以做一些很特别的实验。大家可能都知道，像老鼠这么复杂的动物，也是从单细胞发展出来的。两个半细胞加起来，就一变二，二变四，这样发展出来。我们把很早期小鼠的细胞混合，在这只小鼠取几颗细胞，另外一只老鼠又取几颗细胞，混合在一起，然后将混合的细胞团放进一只母鼠体内，生产出一只小鼠。这只小鼠很特别，一部份来自一只老鼠，另外一部份来自另一只老鼠。不同老鼠有不同的细胞特质，这只有色素（pigment），另一只没有色素，其它起码眼就是正常，大家看到这只混合动物，毛色黑白，很特别。看它的眼底视网膜，色素也都是一片片，有白有黑。在横切的视网膜来看，用同位素加上另一些技术，可以挑出那些细胞是带了基因突变，那些没有。这些是有突变的细胞，旁边是没有突变的，因此视网膜里面有些细胞有突变，有些细胞没有突变，相伴为邻。

当突变的细胞退化时，旁边的正常细胞有什么反映呢？奇怪的是，他们一齐消失。大家从图片看到，视网膜内有正常和不正常的细胞的时候，细胞的雕亡好象是慢些，但奇怪的是，不是局部出现，而是一齐发生。即在动物模型，视网膜里面的感光细胞没有基因突变，也呈现雕亡，大家是否觉得很特别，如果细胞没有基因突变，应该不会死亡，但旁边细胞有突变而死亡的时候，虽然本身正常的细胞没有突变，也都会走上雕亡的路。这是很大的谜。

这是1993年我们发表的论文，在科学和技术上，是非自主权决定的死亡的表达。换句话说，即使你没有基因突变，只要你邻居有基因突变，也会有不良影响，也会同时雕亡。因为有些细胞没有突变，对整个视网膜来讲，退化率会慢些。

回到我刚才讲的概念架构，基因突变本身不单是直接导致细胞死亡的原因，基因突变也引起一些下游的反映，下游的机理比较直接引起这些细胞的退化。我强调这一点，实验的结果，很明显的表现基因突变是导致细胞死亡的因素。基因突变也同时引起一些下游的机理，下游的机理较为直接引起更多视干细胞雕亡，这是一个很重要的观点，符合非自主权引起的死亡。

细胞与细胞互相之间某些活动，引起正常细胞也会死亡。看这个视网膜的结构，有视干细胞，视锥细胞，还有一些双极细胞，那是把视干和视锥感光细胞之后的讯号传达到视网膜里面的神经细胞，然后传送至大脑。在1998年彭有为博士与我一起做这项RP研究，我们制造的猪模型里面，发觉与视干细胞连在一起的双极细胞，当视干细胞退化之后，就会跟视锥细胞有异位的接触。我们在2000年发表了这项发现，看到猪和小鼠里面有异位变迁的现象；2003年我们再发表了RCS老鼠也有同样的表达。目前我们的见解是，这些神经细胞中间的接触，当视干细胞退化时，双极细胞也会有所改变，这正是令混合视网膜里的正常感光细胞呈现雕亡的原因。

这是用电子显微镜做出来的结果，看到视干细胞的尾巴与双极细胞接连的地方，正常的有一个三合位，三合位有两个横向细胞（horizontal cell），和一个双极细胞的突触。我们看到很多RP动物模型，当开始出现退化的时候，涉及双极细胞，三合位出现一个小洞，似乎是神经突触缩了出去。这个小洞的出现，也正好是在三周至四周的时候，跟细胞消失的时间完全吻合。今天有讲者讲过，神经营养因子（neurotrophic factor）可以暂时性拖慢视网膜退化，其中一种叫BDNF，当我们把BDNF注射进小鼠眼睛之后，发觉这些小洞消失了许多，三合体增加，雕亡的细胞减少。也就是说，小洞的出现跟细胞雕亡在时间上有共通点。而当经过这种特别的治疗方法后，可以把小洞的出现和细胞雕亡同时减低。这个结果进一步说明，基因的突变可以说是引起视干感光细胞退化的一种内在因素，但起码在这几个动物模型里面，内在因素引致细胞退化是很缓慢的。而在小鼠里面看到突然间有大量细胞死亡，是外在因素引起的。所谓外在因素，是由于由基因突变引起的视干细胞退化，波及正常有功能的视干细胞提早雕亡。
十年前认识曾建平会长的时候，我研究的主要目的，是怎样可以治疗，先治疗动物，然后把同样的方法用于临床治疗，医治患者。但是经过2000年发现异位突触的现象之后，我改变了态度，觉得我对RP的最大和最有效的贡献，是研究RP病变过程的机理。为什么重要呢？正如我开始时说，到目前并不是没有治疗RP的办法，而是这些治疗方法并不持久和广泛适用，有时成功，有时不成功，这反映我们实在还未了解这些治疗到底是针对什么。如果我们可以了解到病症机理的过程，就可以认真对症下药，那时的治疗就会有更大效力，这是我们目前最大的期望和努力所在。

 

[转自：《视网之窗》第128期]

录入：伊然 添加：2011-01-27